李军义，刘娣，马红，汪亮，霍秀鹏，郝丽*
（1.东北林业大学野生动物与自然保护地学院，哈尔滨，150040；
2.黑龙江省农业科学院畜牧研究所，哈尔滨，150086）
排卵与黄体生成是所有哺乳动物繁殖所必需的，对繁殖性能至关重要。排卵前卵泡颗粒细胞（GC）中的多个信号通路会被黄体生成素激活，这些通路中包含CEBPB所在的信号通路。CEBPB是亮氨酸拉链蛋白家族成员之一，已被证明在多种细胞类型中具有调节细胞增殖和分化及免疫调节的作用，如脂肪生成（前脂肪细胞）［1］、免疫反应（单核细胞和巨噬细胞）［2］、蜕膜（子宫基质细胞）［3］和乳腺上皮细胞分化等［4−6］。在排卵过程中CEBPB基因的增加受到黄体生成素的调节，而CEBPB基因的缺失会最终导致生殖缺陷［7］。
MicroRNAs（miRNAs）是一类内源性非编码调控RNA，长度为18～23 个核苷酸，在转录后水平负调控基因表达。miRNA 在许多生物过程中具有关键调节作用，包括细胞增殖、分化和发育等［8］。自然界中广泛存在的生物发光有机体（如细菌、真菌、鱼和昆虫等）中，催化生物发光反应的为荧光素酶（luciferase），底物为荧光素（luciferin）。荧光素酶可以催化荧光素氧化，同时发出生物荧光（bioluminescence），运用荧光测定仪（即化学发光仪，luminometer）可以检测出生物的荧光强度，当底物过量时，发光量总值与样品荧光酶活性成正比，从而可对荧光素酶报告基因的表达进行间接估计［9］。
哺乳动物黄体正常生成与排卵对于动物的繁殖极为重要，miR-155 是否可以通过靶向CEBPB 调节黄体生成素的激增，进而调节排卵功能的分子机制尚不清楚。王富霞等［10］研究表明，过表达miR-155可以显著抑制NSCLC 细胞的增殖、迁移及侵袭。本研究通过过表达miR-155 后检测与繁殖性能相关基因的变化规律，进而推测miR-155 与卵泡颗粒细胞增殖的关系，通过双荧光素基因报告载体方法 验证两者之间关系，为后续动物繁殖研究提供理论基础。
1.1 CEBPB基因3′UTR双荧光素酶报告基因质粒构建
从miRbase 官网基因数据库中获取miR-155的成熟序列。通过在线生物信息学网站（www.targetscan.org）分析miR-155 的靶基因（图1），推测CEBPB基因是miR-155 的一个靶基因。根据预测，定点缺失种子序列的碱基，构建野生型与突变型双荧光素酶报告基因质粒（图2）。
图1 miR-155靶基因预测Fig.1 miR-155 target gene prediction
图2 miR-155结合位点突变示意图Fig.2 Schematic diagram of binding site mutation
1.2 引物设计
使用Primer 5.0 设计定量引物，反转录引物为通用引物。miR-155、CEBPB及U6 的定量和反转录引物如表1 所示，CEBPB3′UTR 野生型与突变型的引物如表2所示。
表1 miR-155和U6的定量与反转录引物Tab.1 Quantification of miR-155 and U6 with transactivation primers
表2 CEBPB 3′UTR野生型与突变型的引物Tab.2 Primers for wild type and mutant type of CEBPB 3′UTR
1.3 pMD18-T-野生型与突变型质粒构建
以民猪的组织基因组为模板，以表2 中设计的序列为引物，PCR 获取CEBPB基因的野生型与突变型3′UTR 序列。PCR 扩增体系：2×TaqMaster Mix 10.0 μL；
上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL；
模板1.0 μL；
ddH2O 补齐 至20.0 μL。PCR 反应 参数：95 ℃预变性5 min；
95 ℃变性30 s，50～60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸4 min，共计32 个循环；
72 ℃延伸 5 min；
16 ℃保持1 min。参照EasyPure Quick Gel Ex⁃traction Kit 进行纯化回收。回收得到的目的片段与T 载体过夜相连，转化入感受态细胞，经菌液PCR 鉴定后阳性菌落送吉林省库美生物科技股份有限公司测序。参考FastFilter Plasmid DNA Mini Kit D6944说明书抽提阳性菌液质粒用于后续试验。
1.4 CEBPB 基因野生型与突变型双荧光素酶报告载体构建
XhoⅠ和NotⅠ双酶切psi-Check-2 空载体及测序正确的含有野生型与突变型重组T 载体。将双酶切获得的野生型与突变型片段分别连接到线性化的psi-Check-2载体中，载体构建步骤同1.3。
1.5 重组质粒的功能验证
将重组质粒与miR-155 的mimics 和inhibitor 共转染入PK15 细胞，设NC 为对照组，24 h 后检测各组细胞的相对荧光强度。
1.6 反转录与荧光定量PCR
将miR-155 的mimics 和inhibitor 分别转染入PK15 细胞，24 h 后收取细胞提取总RNA，参照Ta⁃KaRa RR047A 反转录试剂盒与TaKaRa RR820A 荧光定量试剂盒分别进行反转录与荧光定量PCR。
2.1 目的DNA片段重组质粒的双酶切鉴定
将构建的pMD18-T-wt 质粒和pMD18-T-mut 质粒双酶切，凝胶电泳后在423、378 bp 左右获得条带（图3），符合预期大小，说明克隆片段成功连入T载。
图3 pMD18-T-wt质粒和pMD18-T-mut质粒双酶切鉴定Fig.3 Identification of pMD18-T-wt plasmid and pMD18-T-mut plasmid by double digestion
2.2 目的DNA片段测序
将野生型和突变型的基因测序结果用DANMAN 软件进行序列比对，结果如图4所示，野生型基因片段相似性为100%，突变型成功突变掉种子区域片段。
图4 野生型和突变型比对结果Fig.4 Comparison results of wild type and mutant
2.3 重组真核表达质粒双酶切鉴定
将构建的psi-Check-2-wt 质粒（图5）和psi-Check-2-mut 质粒（图6）进行双酶切，凝胶电泳后在423、378 bp 左右获得条带，符合预期大小，说明克隆片段成功连入真核表达载体中。
图5 psi-Check-2-wt双酶切鉴定Fig.5 psi-Check-2-wt double enzyme digestion identification
图6 psi-Check-2-mut双酶切鉴定Fig.6 psi-Check-2-mut double enzyme digestion identification
2.4 双荧光素酶相对活性检测
将野生型（wt）和突变型（mut）双荧光酶报告基因重组质粒分别与miR-155 mimics 和miR-155 in⁃hibitor共转染到PK15细胞，NC作为对照。结果如图7A 所示，与NC 相比，miR-155 mimics 显著抑制了野生型质粒的荧光素酶相对活性（p<0.05）；
与NC组相比（图7B），miR-155 inhibitor对野生型质粒荧光相对活性的抑制无显著性差异，同时对突变型质粒荧光素酶活性抑制也不明显，结果表明，miR-155与CEBPB的靶向结合与预期相符，miR-155对CEBPB具有靶向调节作用。
图7 wt和mut相对荧光素酶活性Fig.7 Relative luciferase activities of wt and mut
2.5 miR-155 mimics 与inhibitor 转染后CEBPB基因的表达
miR-155 mimics与miR-155 inhibitor分别转染到PK15 细胞中，24 h 后收取细胞，提取细胞总RNA，反转录、实时荧光定量检测miR-155 以及CEBPB基因的表达变化。结果表明，与转染阴性对照组相比，转染miR-155 mimics 促使miR-155 过表达（p<0.001）（图8A），基因CEBPB表达受到抑制（p<0.001）；
转染miR-155 inhibitor 结果正好与mimics 组相反，miR-155 的表达受到抑制，而基因CEBPB的表达得到促进（p<0.05）（图8B）。在miR-155 mimics组繁殖性能相关基因BMP1、PPARG的表达量受到显著抑制（图8C）；
BMP1、PPARG在miR-155 inhibtor 组的表达量显著升高（p<0.05）（图8D）。
图8 miR-155的mimics和inhibitor转染结果Fig.8 Results of the mimics and inhibitor transfection of miR-155
CEBPB是转录因子CEBP 家族中极其重要的一员。CEBPB主要通过信号传导途径来发挥其功能，它能对多种胞外信号分子产生应答，进而对靶基因的表达水平进行调节［11］。排卵过程受到转录因子的影响，CEBPB是其中的转录因子之一［12］。在排卵前的卵泡中，CEBPB增加受黄体生成素的调节，并且以依赖ERK1/2 的方式激活［13］。有针对性地破坏CEBPB基因会导致卵巢和子宫的生殖缺陷［14］，如排卵与黄体化失败、膜退化和增殖等。miR-155是一个多功能小RNA 分子，在细胞增殖、分化和免疫等方面均发挥重要的作用，它可以靶向目标基因影响其发挥功能。有研究证明，miR-155 在多卵巢综合征（PCOS）组大鼠卵巢组织中的表达量显著增高［15］。此外，miR-155 在RIF 患者子宫内膜中也表现出表达量上调，并且有可能通过调控MMP16基因来影响子宫内膜的容受性［16］。miR-155 基因敲减的小鼠被证明无优势卵泡，有较多小卵泡，无黄体，颗粒细胞减少，卵泡膜明显增厚，间质细胞增生显著［15］。复发性流产小鼠体内miR-155 表达下调；
正常怀孕的小鼠，其早孕着床过程的子宫内膜组织中，miR-155的表达量随着妊娠时间增加也出现下调的趋势［17］。因此，miR-155对繁殖性能具有重要的调节作用。
本研究结果表明，CEBPB是miR-55 的靶基因，两者具有负向调控的作用。miR-155 mimics wt 组荧光素酶的活性受到显著抑制，实时荧光定量结果表现为miR-155 mimics组CEBPB的相对表达量相对于NC 组明显受到抑制（p<0.05），而miR-155 inhibitor组CEBPB的相对表达量显著升高（p<0.05）。Oliveira等［18］研究表明，miR-155与CEBPB、HOMAIR 和血浆纤维蛋白原呈负相关，与血清脂联素呈正相关，本研究结果与其相似。繁殖性能相关基因BMP1、PPARG与miR-155 的表达水平在体外水平呈负相关。BMP1可以靶向靶基因促进体外培养颗粒细胞增殖并抑制细胞凋亡［19］；
PCOS病人体内PPARG的表达量明显降低，PPARG缺失型剪接变体过表达后的细胞增殖、迁移及凋亡均下调，表明PPARG可以调节卵母细胞的增殖凋亡等［20］，而miR-155 可能通过抑制BMP1与PPARG基因的表达水平进而抑制颗粒细胞的增殖与凋亡等。
双荧光素酶报告基因检测系统具有诸多优点，如无细胞毒性、反应灵敏且稳定等，该系统中的萤火虫和海肾荧光素酶能催化荧光素氧化并发出可量化的荧光，目前在转录水平和信号通路等方面得到广泛应用，可用于microRNA 与基因是否具有靶向关系的验证。李池慧等［21］应用该技术构建了KSR2基因3′UTR 双荧光素酶报告基因载体并且验证了hcmvmiR-UL70-3p 和hcmv-miR-US4-3p 靶向关系。本研究表明miR-155 可以靶向结合CEBPB基因的3′UTR，表明miR-155与CEBPB存在靶向关系，之后可以通过转染miR-155 的mimics 和inhibitor 观察两者之间的具体关系，为后续研究miR-155与CEBPB在卵细胞中的调控关系做准备。
猜你喜欢 双酶突变型荧光素酶 NNMT基因启动子双荧光素酶报告系统的构建及其与SND1靶向关系的验证天津医科大学学报(2021年4期)2021-08-21不同双荧光素酶方法对检测胃癌相关miRNAs靶向基因TIAM1的影响中日友好医院学报(2021年1期)2021-04-14重组双荧光素酶报告基因质粒psiCHECK-2-Intron构建转染及转染细胞萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶表达山东医药(2020年9期)2020-05-20放疗与酪氨酸激酶抑制剂治疗表皮生长因子受体突变型非小细胞肺癌脑转移的研究进展▲广西医学(2020年13期)2020-03-04BamHⅠ+XhoⅠ双酶切质粒电泳弥散原因初探山西医科大学学报(2017年11期)2017-12-01鹿骨双酶法酶解工艺的研究食品研究与开发(2016年9期)2016-06-13超声波辅助复合酶提取鸡软骨中硫酸软骨素哈尔滨商业大学学报（自然科学版）(2016年1期)2016-04-22聚能双酶水溶肥农村百事通(2015年8期)2015-05-19肾脏肿瘤中突变型p53和CD44v6基因产物的表达分析中国现代医生(2015年5期)2015-03-31人多巴胺D2基因启动子区—350A/G多态位点荧光素酶表达载体的构建与鉴定及活性检测中国医药导报(2015年27期)2015-02-28